Kỹ thuật điện di

Điện di (electrophoresis) là một trong những phương pháp chủ chốt trong hóa học, hóa sinh và sinh học phân tử, cùng với sắc ký. Phương pháp này thường được dùng để tinh chế và phân tích các phân tử sinh học như axit nucleic, protein và một số phức hợp carbohydrat, lipid.

Nguyên lý cơ bản

Điện di là hiện tượng mà các vật thể mang điện tích di chuyển dưới ảnh hưởng của một điện trường. Chuyển động này được gây ra bởi lực điện trong lực Lorentz.

Điện di trên gel (gel electrophoresis) là một kỹ thuật trong sinh học phân tử dùng để phân tích các phân tử DNA, RNA hoặc protein dựa trên các đặc tính vật lý của chúng như kích thước, hình dạng và điểm đẳng điện. Kỹ thuật này sử dụng dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo ra một điện trường đồng đều, một bản gel (thường là agarose hoặc polyacrylamide) làm môi trường phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện các phân tử trên gel sau khi điện di. Kỹ thuật hoạt động nhờ lực điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước của lỗ gel. Gel là một mạng lưới các chuỗi polymer liên kết chéo với nhau, với kích thước lưới thay đổi theo nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo. Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với tốc độ khác nhau nhờ vào sự khác biệt về (a) lực điện trường tác động (nếu các phân tử có điện tích khác nhau) (b) kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và (c) hình dạng và độ cồng kềnh của phân tử.

Chuẩn bị gel

Gel agarose

Gel agarose là một polysaccharide được chiết xuất chủ yếu từ rong biển đỏ. Nó là một polymer tuyến tính bao gồm các đơn vị lặp lại của agarobiose, một disaccharide kết hợp từ D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactopyranose. Agarose là thành phần chính của thạch, được tách ra từ thạch bằng cách loại bỏ agaropectin. Agarose có cấu trúc lưới ba chiều với các kênh có đường kính từ 50 nm đến trên 200 nm tùy theo nồng độ của agarose - nồng độ cao hơn tạo ra lỗ chân lông nhỏ hơn. Cấu trúc ba chiều này được liên kết bởi các liên kết hydro và có thể bị phá vỡ khi làm nóng để trở lại trạng thái lỏng.

Nhờ vào cấu trúc lưới lý tưởng của nó, agarose thường được sử dụng trong sinh học phân tử để phân tách các phân tử lớn, đặc biệt là DNA, thông qua phương pháp điện di. Các tấm gel agarose (thường có nồng độ từ 0,7 - 2%) được tạo ra dễ dàng bằng cách đổ dung dịch ấm và lỏng vào khuôn. Có sẵn nhiều loại agarose với trọng lượng phân tử và tính chất khác nhau để phục vụ cho mục đích này. Agarose cũng có thể được chuyển đổi thành hạt và sử dụng trong một số phương pháp sắc ký để tinh sạch protein.

Gel polyacrylamide

Khi acrylonitrile được hydrat hóa, nó tạo ra acrylamide (C 3 H 5 NO) nhờ vào enzym nitrile hydratase.

Acrylamide tồn tại dưới dạng bột trước khi được hòa tan trong nước. Do acrylamide có khả năng gây độc cho hệ thần kinh, cần phải tuân thủ các biện pháp an toàn khi làm việc với chất này.

Acrylamide hòa tan trong nước và khi thêm nước, nó sẽ trải qua quá trình polymer hóa để hình thành polyacrylamide. Kỹ thuật này rất quan trọng trong việc chế tạo gel polyacrylamide vì nó cho phép điều chỉnh kích thước lỗ chân lông của gel. Nồng độ acrylamide cao hơn dẫn đến kích thước lỗ chân lông nhỏ hơn sau quá trình trùng hợp. Gel polyacrylamide với lỗ chân lông nhỏ giúp phân tách các phân tử nhỏ hơn hiệu quả hơn vì các phân tử nhỏ có thể xuyên qua gel dễ dàng hơn, trong khi các phân tử lớn bị mắc kẹt tại các lỗ hở.

Các phương pháp điện di phổ biến

Điện di trên gel agarose

Điện di trên gel agarose là phương pháp phổ biến để phân tích DNA trong các phòng thí nghiệm. Gel agarose có khả năng phân giải DNA thấp hơn so với gel acrylamide, nhưng có phạm vi phân tách rộng hơn, thường được dùng cho các đoạn DNA dài từ 50 đến 20,000 bp (cặp base), mặc dù độ phân giải lên đến hơn 6 Mb cũng có thể đạt được với phương pháp điện di trường pulsed (PFGE). Phương pháp này cũng phù hợp để phân tách các phân tử protein lớn và là lựa chọn ưu tiên cho các hạt có bán kính hiệu quả lớn hơn 5-10 nm.

Kích thước lỗ chân lông của gel ảnh hưởng đến khả năng phân tách DNA. Gel với nồng độ thấp có lỗ chân lông lớn hơn, giúp phân tách các đoạn DNA lớn hơn. Tuy nhiên, gel nồng độ thấp (0,1 - 0,2%) dễ bị hỏng và khó xử lý, trong khi điện di của các phân tử DNA lớn có thể mất vài ngày. Giới hạn độ phân giải của gel agarose thường là khoảng 750 kb, nhưng có thể vượt qua bằng phương pháp PFGE, nơi các trường điện trực giao xen kẽ được áp dụng. Các mảnh DNA sẽ tự định hướng lại khi trường điện thay đổi, nhưng các phân tử lớn hơn mất thời gian lâu hơn để điều chỉnh.

Gel agarose được đổ vào khuôn và khi đông cứng, nó thường được sử dụng để chạy điện di trong dung dịch đệm. Các bộ đệm phổ biến như Tris-acetate-EDTA và Tris-Borate-EDTA thường được sử dụng, nhưng cũng có thể dùng các bộ đệm khác như Tris-phosphate, acid barbituric-sodium barbiturate, hoặc Tris-barbiturate. DNA thường được nhuộm bằng ethidium bromide (một chất có thể gây ung thư) và quan sát dưới ánh sáng UV, nhưng cũng có thể sử dụng các phương pháp nhuộm khác như SYBR Green, GelRed, xanh methylen, và tinh thể tím. Nếu cần tách các đoạn DNA để phân tích thêm, chúng có thể được cắt ra từ gel để tiếp tục xử lý.

Điện di trên gel polyacrylamide

Kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide thường được áp dụng cho phân tích protein, DNA và các phân tử tương tự. Nguyên lý hoạt động của nó tương tự như điện di trên gel agarose. Gel polyacrylamide cung cấp độ phân giải cao, thường được sử dụng để phân tích các phân tử DNA có kích thước và độ dài từ 50 đến 30,000 cặp base. Với nồng độ gel từ 6% đến 20%, độ phân giải tăng khi nồng độ gel cao. Gel polyacrylamide thường được ưu tiên cho các phân tử có kích thước nhỏ hơn so với gel agarose, nhưng chuyển sang gel agarose khi phân tích DNA dài hơn 30,000 cặp base. Dung dịch đệm phổ biến cho phương pháp này là Tris-borate-EDTA.

• Điện di trong nghiên cứu dược phẩm