Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là phương pháp sắc ký được dùng để phân tách các thành phần trong hỗn hợp. Kỹ thuật này sử dụng một lớp mỏng chất hấp phụ như silica gel, nhôm oxit, hoặc cellulose được phủ trên bề mặt phẳng. Dung dịch phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và được kéo lên lớp sắc ký nhờ mao dẫn, từ đó phân tách các thành phần dựa trên tính phân cực của chúng.

Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:

• Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất phóng xạ trong ngành dược phẩm
• Xác định sắc tố trong tế bào thực vật
• Phát hiện thuốc trừ sâu và thuốc diệt côn trùng trong thực phẩm
• Nhận diện các chất trong mẫu thử
• Theo dõi các phản ứng hóa học hữu cơ

Một số cải tiến có thể kết hợp với phương pháp truyền thống để tự động hóa một số bước, nâng cao hiệu suất của sắc ký lớp mỏng và cung cấp dữ liệu chính xác hơn. Phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC).

Chuẩn bị bản sắc ký

Bản sắc ký được chế tạo bằng cách trộn chất hấp phụ, như silica gel, với một lượng nhỏ chất kết dính, như canxi sulfat (thạch cao), và nước. Hỗn hợp này được trải thành một lớp dày trên bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa. Sau đó, bản sắc ký được để khô và kích hoạt bằng cách nung trong lò ở nhiệt độ 110 °C trong 30 phút. Độ dày của lớp hấp phụ thường từ 0.1-0.25 mm cho phân tích hóa học, và khoảng 1-2mm cho sắc ký lớp mỏng chuẩn bị. Tất cả các kỹ thuật sắc ký đều bao gồm một pha động và một pha tĩnh.

Kỹ thuật

Phương pháp thực hiện tương tự như sắc ký giấy nhưng nhanh hơn, tách hỗn hợp hiệu quả hơn, và có nhiều lựa chọn cho các 'pha tĩnh' khác nhau. Nhờ tính đơn giản và nhanh chóng, sắc ký lớp mỏng thường được sử dụng để theo dõi các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng.

Một giọt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được đặt lên bản sắc ký, cách cạnh dưới khoảng 1 cm. Sau đó, bản sắc ký được ngâm trong một dung môi phù hợp, như ethanol hoặc nước, và đặt vào một bình có nắp. Dung môi di chuyển lên bản sắc ký nhờ mao dẫn, tiếp xúc với mẫu thử và kéo mẫu thử lên trên. Các hợp chất trong mẫu thử di chuyển với tốc độ khác nhau do sức hút của chúng đối với pha tĩnh và khả năng hòa tan trong dung môi khác nhau.

Các hợp chất được phân tách dựa trên sự cạnh tranh giữa chất tan và pha động để liên kết với pha tĩnh. Ví dụ, nếu sử dụng silica gel làm pha tĩnh, nó sẽ phân cực. Trong trường hợp hai hợp chất có tính phân cực khác nhau, hợp chất có tính phân cực cao hơn sẽ liên kết chặt hơn với silica gel và do đó đẩy pha động ra khỏi các điểm liên kết. Kết quả là hợp chất có tính phân cực thấp hơn sẽ di chuyển cao hơn trên bản sắc ký (tức là hệ số lưu R_f lớn hơn). Nếu pha động là dung môi phân cực hơn hoặc hỗn hợp dung môi, nó sẽ đẩy các chất tan ra khỏi điểm liên kết với silica gel, làm tất cả các hợp chất di chuyển cao hơn trên bản sắc ký. Ví dụ, dùng hỗn hợp ethyl axetat và heptan làm pha động, thêm ethyl acetate sẽ làm tăng hệ số lưu R_f cho tất cả các hợp chất. Thay đổi độ phân cực của pha động không làm thay đổi thứ tự di chuyển của các hợp chất. Để thay đổi thứ tự di chuyển, cần sử dụng một pha tĩnh không phân cực, như C18-silica chức năng hóa.

Dung môi thích hợp cho sắc ký lớp mỏng là dung môi có độ phân cực khác biệt với pha tĩnh. Nếu dùng dung môi phân cực để hòa tan mẫu thử trên pha tĩnh phân cực, vệt mẫu thử sẽ lan rộng do mao dẫn, và các vệt có thể bị trộn lẫn. Do đó, để giảm sự lan rộng của vệt, dung môi hòa tan mẫu thử nên là không phân cực hoặc phân cực nhẹ nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại.

Phân tích

Khi một số hóa chất sau khi tách ra trở nên không màu, có thể sử dụng một số phương pháp để quan sát các vệt này:

• Thường thì, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, như kẽm silicat được kích hoạt bởi mangan, được thêm vào chất hấp phụ để quan sát các vệt dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV₂₅₄). Lớp hấp phụ sẽ phát ra ánh sáng màu xanh lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm giảm ánh sáng này.
• Hơi I-ốt cũng là một thuốc thử màu phổ biến.
• Các thuốc thử màu đặc trưng có thể được dùng để nhúng vào bản sắc ký hoặc xịt lên bản sắc ký.
• Đối với các chất béo, sắc ký có thể được chuyển sang một màng polyvinylidene fluoride (PVDF) và sau đó phân tích sâu hơn, chẳng hạn như bằng khối phổ.

Khi các vệt đã có thể quan sát được, hệ số lưu R_f của mỗi vệt sẽ được xác định bằng cách chia khoảng cách di chuyển của hợp chất với khoảng cách di chuyển của dung môi. Những số liệu này phụ thuộc vào loại dung môi và loại bản sắc ký sử dụng, và không phải là hằng số cố định.

Ứng dụng

Trong hóa học hữu cơ, sắc ký lớp mỏng được sử dụng để theo dõi chất lượng phản ứng. Các mẫu thử được đưa lên bản sắc ký bằng ống mao dẫn: một vệt của chất ban đầu, một vệt từ hỗn hợp phản ứng, và một vệt chứa cả hai chất. Một bản sắc ký nhỏ (3 cm x 7 cm) mất khoảng hai đến ba phút để thực hiện. Quá trình này giúp phân tích chất lượng và cho thấy liệu chất ban đầu đã biến mất, sản phẩm đã hình thành và số lượng sản phẩm ra sao. Tuy nhiên, sắc ký lớp mỏng có thể không chính xác với các phản ứng xảy ra ở nhiệt độ thấp, vì các mẫu thử có thể bị làm nóng trong mao dẫn. Ví dụ như phản ứng khử ester bởi DIBALH thành aldehyde.

Một ví dụ minh họa là việc áp dụng sắc ký cho một mẫu lá xanh (ở đây là rau chân vịt) qua 7 giai đoạn. Carotene tách ra ngay lập tức và chỉ có thể quan sát được đến giai đoạn 2. Chlorophyll A và B xuất hiện rõ rệt ở giữa bản sắc ký trong giai đoạn cuối cùng, trong khi lutein là hợp chất đầu tiên tạo màu vàng trên bản sắc ký.

Trong một nghiên cứu, phương pháp sắc ký lớp mỏng đã được áp dụng để phân tích phản ứng hóa học hữu cơ, chẳng hạn như tổng hợp BINAP từ 2-naphtol. Trong quy trình này, cồn và dung dịch xúc tác (như chloride sắt(III)) được đặt riêng biệt trên bản sắc ký, sau đó chúng phản ứng với nhau và được phân tích ngay lập tức.

Các tài liệu tham khảo

• Sách hướng dẫn sắc ký lớp mỏng, Sherma, J. và Fried, B. (tác giả) ấn bản lần thứ 3. Marcel Dekker, New York.

• Hóa học phân tích
• Sắc ký khí