Phân tích sắc ký

Sắc ký (tiếng Anh: chromatography, từ tiếng Hy Lạp là χρῶμα chroma nghĩa là 'màu sắc' và γράφειν graphein nghĩa là 'ghi lại') là một kỹ thuật phân tích phổ biến trong phòng thí nghiệm hóa học phân tích, dùng để tách các thành phần trong hỗn hợp. Kỹ thuật này liên quan đến việc cho mẫu chứa chất cần phân tích vào 'pha động', thường là dòng dung môi, di chuyển qua 'pha tĩnh.' Pha tĩnh làm chậm sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách ra theo thời gian, giống như các vận động viên marathon. Lý tưởng nhất, mỗi thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là 'thời gian lưu.'

Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp được vận chuyển trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra dựa trên sự phân bố khác nhau khi chúng di chuyển qua pha tĩnh rắn hoặc lỏng. Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được áp dụng để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên tính tương thích khác nhau của các chất trong môi trường động khí hoặc lỏng và môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng đi qua, như giấy, gelatin hoặc gel magie silicate.

Sắc ký phân tích được sử dụng để xác định danh tính và nồng độ các phân tử trong hỗn hợp. Sắc ký tinh chế được áp dụng để tinh chế các chất có trong hỗn hợp.

Lịch sử

Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát minh ra phương pháp sắc ký vào năm 1903 khi ông nghiên cứu về chlorophyll. Từ sắc trong sắc ký chỉ màu sắc; nó vừa phản ánh tên của Tsvet theo nghĩa tiếng Nga, vừa mô tả màu sắc của các sắc tố thực vật mà ông phân tích lúc bấy giờ. Dù các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc, tên gọi này vẫn được duy trì.

Năm 1952, Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge được trao giải Nobel Hóa học vì phát minh của họ về sắc ký phân bố.

Kỹ thuật sắc ký đã phát triển mạnh mẽ suốt thế kỷ 20. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên lý cơ bản của sắc ký Tsvet có thể áp dụng theo nhiều cách khác nhau, dẫn đến sự xuất hiện của nhiều loại sắc ký mới. Đồng thời, kỹ thuật thực hiện sắc ký cũng liên tục được cải tiến, cho phép phân tích các phân tử gần giống nhau.

Thuật ngữ

• Pha động: Chất lỏng hoặc khí di chuyển cùng với các thành phần trong hỗn hợp.
• Pha tĩnh: Chất dùng để tách các thành phần trong hỗn hợp, thường không di chuyển cùng với chúng. Ví dụ: Silica trong sắc ký lớp mỏng.
• Dung môi: Chất lỏng dùng để tách các thành phần từ hỗn hợp.
• Sắc ký đồ: Đồ thị thể hiện sự thay đổi đáp ứng của máy dò theo thời gian.

Nguyên lý sắc ký

Sắc ký là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự khác biệt giữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp. Các thành phần có thể tương tác với pha tĩnh dựa trên các yếu tố như điện tích, độ hòa tan và khả năng hấp phụ.

Mức lưu giữ

Mức lưu giữ đo tốc độ di chuyển của một chất trong hệ thống sắc ký. Trong các hệ thống liên tục như HPLC hay GC, mức lưu giữ được đo bằng thời gian lưu (Retention time) R_t hoặc t

_R, khoảng thời gian từ khi tiêm mẫu đến khi phát hiện. Trong các hệ thống ngắt quãng như TLC, mức lưu giữ được đo bằng hệ số lưu R_f, tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của hợp chất so với khoảng cách di chuyển của chất chiết xuất. Hệ số lưu của hỗn hợp được tính theo công thức:

$R_f=\frac{l}{l_0}$

Trong đó, $R_f$ là hệ số lưu, $l$ là khoảng cách từ vạch xuất phát đến trung tâm vệt sắc ký (khoảng cách mà mẫu đã di chuyển), $l_0$ là khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi (khoảng cách mà dung môi đã di chuyển)

Mức lưu giữ của một chất có thể thay đổi đáng kể giữa các thí nghiệm và phòng thí nghiệm khác nhau do sự khác biệt về chất chiết xuất, pha tĩnh, nhiệt độ và thiết kế thí nghiệm. Do đó, việc so sánh mức lưu giữ của hợp chất cần khảo sát với một hoặc nhiều hợp chất chuẩn trong cùng điều kiện là rất quan trọng.

Các phương pháp sắc ký

Sắc ký trên giấy

Đây là một phương pháp sắc ký phân bố dựa trên cellulose. Trong phương pháp này, người ta nhỏ một giọt dung dịch phân tích lên giấy sắc ký. Các thành phần trong dung dịch sẽ được tách ra ở các vị trí khác nhau trên giấy nhờ sự phân bố khác biệt giữa dung môi và dung dịch nước.

Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (TLC: thin layer chromatography) là một kỹ thuật sắc ký nhanh chóng và tiện lợi. Phương pháp này giúp xác định nhanh chóng số lượng các thành phần trong hỗn hợp phân tích. Trong sắc ký lớp mỏng, các thành phần của hỗn hợp được nhận diện bằng cách so sánh hệ số lưu R_f của mẫu với các hệ số lưu Rf của các chất đã biết.

Bản sắc ký dùng trong phương pháp lớp mỏng thường được làm từ thủy tinh, nhôm hoặc plastic và được phủ một lớp chất rắn mỏng như silica gel, nhôm oxit, polyamide hoặc cellulose.

Sắc ký cột

Sắc ký cột (column chromatography) là kỹ thuật sắc ký sử dụng cột chứa pha tĩnh như silica gel, alumina, canxi phosphat, canxi cacbonat, hoặc tinh bột. Cột sắc ký có thể được lấp đầy hoàn toàn với pha tĩnh hoặc chỉ tập trung pha động ở các bên của ống để pha động có thể di chuyển qua. Trong phương pháp này, cột sắc ký phân tách mẫu bên trong ống silica, trong khi dung môi giúp đẩy mẫu xuống dưới cột. Các mẫu tương tác tốt với pha động sẽ di chuyển chậm hơn trên cột so với những mẫu tương tác kém với pha tĩnh.

Sắc ký khí-lỏng

Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký trao đổi ion (Ion-exchange chromatography, viết tắt là IC) là kỹ thuật phân tách các ion hoặc phân tử phân cực dựa vào tính chất của chúng. Độ trao đổi ion giữa các phân tử mang điện tích và nhóm điện tích trên nền cột thay đổi theo pH. Vì độ pH quyết định trạng thái điện tích của các phân tử protein trong dung dịch protein thô khi nạp vào cột. Sự tách biệt được thực hiện theo tuyến tính bằng cách thay đổi pH hoặc nồng độ muối của dung dịch đệm để thôi cột. Dòng chảy ra khỏi cột được đo ở bước sóng 280 nm.

Sắc ký ái tính ion với kim loại bất động

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp này phân tách bằng cách sử dụng pha động là chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn, được phân chia thành tiểu phân hoặc là chất lỏng phủ trên chất mang rắn, hoặc chất mang được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Sắc ký lỏng dựa vào cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, hoặc phân loại theo kích cỡ (rây phân tử).

Sắc ký lọc gel

Hoạt động dựa trên nguyên lý phân tách các phân tử theo kích thước và khối lượng khác nhau khi chúng di chuyển qua nền nhựa xốp. Khi hỗn hợp protein được đưa vào cột, các phân tử protein nhỏ sẽ thấm vào các lỗ trong nền cột, trong khi các protein lớn không thể thấm vào và tiếp tục di chuyển dọc theo cột, ra ngoài sớm hơn so với các phân tử nhỏ. Sắc ký lọc gel thường được sử dụng để loại bỏ muối và các phân tử nhỏ, tinh sạch các phân tử sinh chất trong mẫu nhỏ và xác định trọng lượng phân tử.

Sắc ký ái lực

Là phương pháp tách biệt và đặc hiệu các sinh chất dựa trên khả năng tương tác đặc hiệu của chúng với nền sắc ký qua các liên kết như kháng nguyên-kháng thể hoặc enzyme-cơ chất. Sau đó, sử dụng đệm phù hợp để rửa trôi các sinh chất mong muốn ra khỏi cột. Các tay nối sinh học đặc hiệu thường là những chất có mặt trong các phản ứng sinh hóa.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) là phương pháp sắc ký dùng để phân tách và định lượng các sinh chất dưới áp suất cao, giúp giảm đáng kể thời gian và nâng cao hiệu quả phân tích. Ưu điểm của phương pháp này là giảm thời gian tách và thu mẫu nhờ việc thực hiện sắc ký dưới áp suất cao, với chất mang thường là polymer hữu cơ như polystyren hoặc hạt silicagel.

Liên kết bên ngoài