Nguyên nhân được xác định là do tài xế không hiểu được biển báo. Tại nút giao Thân Cửu Nghĩa trên con đường cao tốc TP.HCM - Trung Lương nối với con đường cao tốc Trung Lương - Mỹ Thuận, có nhiều phương tiện di chuyển ngược chiều nhưng lại dừng lại để hỏi lực lượng điều tiết, sau đó lùi xe để tiếp tục di chuyển.
Nhiều tài xế không chú ý đến biển báo, dẫn đến tình trạng ùn tắc giao thông khi đến ngã rẽ vào thành phố Mỹ Tho từ cao tốc Quốc lộ 1, trong khi hướng khác nối vào đường cao tốc Trung Lương - Mỹ Thuận.
Một CSGT điều tiết tại nút giao Thân Cửu Nghĩa cho biết, ban đầu do biển báo chưa rõ và thiếu nên nhiều tài xế lúng túng hướng đi. Sau đó đơn vị chủ quản đã thay thế biển báo và lắp đặt thêm nhiều biển báo trên con đường cao tốc TP.HCM - Trung Lương đi vào đường cao tốc Trung Lương - Mỹ Thuận, dẫn đến giảm số lượng tài xế dừng lại để hỏi đường. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều tài xế không chú ý đến biển báo và vẫn dừng xe hỏi đường, gây ra ùn tắc giao thông và có nguy cơ xảy ra tai nạn tại nút giao này.
Ngoài ra, lực lượng điều tiết phải cố gắng hướng dẫn xe đầu kéo, xe bồn, xe quá khổ... vào hướng con đường Quốc lộ 1 vì chưa được phép di chuyển vào con đường cao tốc Trung Lương - Mỹ Thuận.
Tại nút giao Thân Cửu Nghĩa vào ngày 25 và sáng ngày 26 tháng 1, khi các phương tiện gần kết thúc tuyến đường cao tốc TP.HCM - Trung Lương muốn đi vào đường cao tốc Trung Lương - Mỹ Thuận, tài xế cần lưu ý quan sát biển báo trên cột đèn và ven đường, sau đó cho xe đi thẳng nếu muốn đến Mỹ Thuận, còn muốn đi ra Quốc lộ 1 về Mỹ Tho và Bến Tre thì rẽ phải.
Cơ quan chức năng nhấn mạnh, nếu các xe muốn vào Quốc lộ 1 để đi về Mỹ Tho và Bến Tre mà nhầm vào đường cao tốc Trung Lương - Mỹ Thuận thì phải lưu thông suốt tuyến đến nút giao An Thái Trung mới ra được Quốc lộ 1 vì hiện tại các đường rẽ xuống Cai Lậy, Cái Bè chưa được sử dụng.
Trước đó, vào ngày 22 tháng 1, UBND tỉnh Tiền Giang đã đồng ý phương án lưu thông trên đường cao tốc Trung Lương - Mỹ Thuận trong dịp Tết Nguyên Đán 2022. Theo đó, từ ngày 25.1 (tức ngày 23 tháng Chạp) đến ngày 10.2 (tức mùng 10 Tết Nhâm Dần), ô tô được phép đi 2 chiều trên tuyến chính từ Thân Cửu Nghĩa đến An Thái Trung thuộc huyện Cái Bè qua đường cao tốc Trung Lương - Mỹ Thuận với tốc độ tối đa là 80km/h.
Các loại phương tiện không được phép đi vào đường cao tốc này bao gồm: Xe quá khổ, quá tải, xe chở container từ 20 feet trở lên, xe đầu kéo kéo theo sơ mi - rơ mooc, xe chở vật liệu dễ cháy nổ như xăng dầu, gas, nhựa đường..., người đi bộ, xe máy, xe thô sơ, xe gắn máy. Do đường nối từ đường cao tốc vào đường cao tốc Trung Lương - Mỹ Thuận chưa hoàn thành nên các phương tiện trên Quốc lộ 1 chưa thể vào đường cao tốc Trung Lương - Mỹ Thuận được.