Thử nghiệm biuret

Thử nghiệm biuret, còn được gọi là phản ứng biuret hoặc thử nghiệm Piotrowski, là một thử nghiệm hóa học được sử dụng để nhận biết sự hiện diện của liên kết peptide. Khi có peptide, ion đồng(II) tạo thành phức chất màu tím trong dung dịch kiềm. Có một số biến thể của thử nghiệm này đã được phát hiện, như thử nghiệm BCA và thử nghiệm Lowry đã được sửa đổi.

Phản ứng biuret cũng có thể được sử dụng để đánh giá nồng độ của protein, bởi vì liên kết peptit xuất hiện với cùng mức độ của các axit amin trong peptide. Theo định luật Beer-Lambert, độ đậm của màu tím và khả năng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 540 nm tỉ lệ thuận với nồng độ protein.

Mặc dù có tên là thuốc thử biuret, phản ứng này không chứa biuret (H₂N-CO-)₂NH. Tên gọi này xuất phát từ tính dương tính của nó đối với liên kết peptide như trong phân tử biuret.

Trong phản ứng này, đồng(II) kết hợp với nitơ có trong peptide của protein, đồng thời bị giảm về đồng(I). Các chất đệm như Tris và amoni ngăn chặn phản ứng này, khiến nó không phù hợp cho mẫu protein được chiết từ kết tủa amoni sunfat. Phương pháp này chủ yếu được áp dụng cho mẫu mô lớn và các nguồn chứa nhiều protein do tính nhạy kém và ít bị ảnh hưởng từ amino acid tự do.

Bước đầu tiên

Thêm dung dịch mẫu thử vào dung dịch base mạnh 1% như natri hydroxide hoặc kali hydroxide cùng lượng giọt đồng(II) sunfat. Nếu hỗn hợp chuyển sang màu tím, đó là dấu hiệu của sự hiện diện protein. Phản ứng có thể phát hiện nồng độ protein từ 5–160 mg/mL. Peptit phải có ít nhất 3 amino acid mới có sự thay đổi màu đáng kể.

Thử nghiệm thuốc biuret

Chất thử cho phản ứng biuret bao gồm natri hydroxide (NaOH) và đồng(II) sunfat ngậm nước, kèm với kali natri tartrate, được sử dụng để tạo phức chất và ổn định ion đồng. Phản ứng giữa ion Cu và nhóm nitơ trong liên kết peptit dẫn đến sự thế nguyên tử hydro peptide trong môi trường kiềm.

Biến thể cực kỳ nhạy

Hai biến thể của phép thử biuret thường được áp dụng trong các phương pháp phân tích hiện đại để phát hiện peptide: phân tích axit bicinchoninic (BCA) và phân tích Lowry. Trong những phương pháp này, ion Cu tạo thành trong phản ứng biuret tiếp tục phản ứng với các chất khác, dẫn đến màu sắc nổi bật hơn.

Trong phép thử BCA, Cu tạo thành một phức chất màu tím đậm sau khi phản ứng với axit bicinchoninic (BCA), hấp thụ tại bước sóng khoảng 562 nm, tạo thành màu cẩm quỳ đặc trưng. Phức chất BCA/đồng tan được và hấp thụ mạnh hơn rất nhiều so với phức chất peptide/đồng, tăng độ nhạy của phép thử biuret lên khoảng 100 lần: phân tích BCA cho phép phát hiện protein với nồng độ từ 0,0005 đến 2 mg/mL. Ngoài ra, phương pháp phân tích protein BCA còn tương thích với nhiều chất khác như chất hoạt động bề mặt, với nồng độ lên đến 5% trong mẫu thử protein.

Trong phương pháp phân tích protein Lowry, Cu được tái oxy hóa thành Mo bởi Mo (có trong thuốc thử Folin–Ciocalteu), tạo thành molypden xanh dương. Tyrosine có trong protein cũng tạo thành molypden xanh dương trong điều kiện này. Phương pháp này có thể phát hiện protein với nồng độ từ 0,005 đến 2 mg/mL. Molypden xanh dương có thể kết hợp với các chất nhuộm hữu cơ như malachi xanh lục hay Auramine O, tăng cường độ nhạy của phản ứng.

Ở Ba Lan, phép thử này còn được biết đến với tên gọi là phép thử Piotrowski, để vinh danh nhà sinh lý học người Ba Lan Gustaw Piotrowski (sinh năm 1833), người mô tả thí nghiệm này lần đầu vào năm 1857.

Liên kết ngoài

• Các loại thuốc thử hóa học

Bản mẫu: Thuốc thử phân tích